جدیدا به جای استفاده از آمفولایت ها که عدم تکرار پذیری و مشکلات زیادی دارند ، IPG ها بر اساس استفاده از معرفهای ایموبلاین Immobiline تهیه می شوند .ایموبلاینها مشتقات ده گانه ای از کربن آمید هستند که ساختار پایه ای یکسانی دارند (PH=1-12) . بافرهای ایموبلاین دسته مولکولهای شناخته شده ای هستند که هر یک دارای یک گروه بافر کننده اسیدی یا بازی متصل به یک مونومر کربن آمید هستند . از آنجایی که انتهای واکنش دهنده مولکول با ماتریکس آکریل آمید پلیمره می شود ، ایموبلاین های بافر کننده در حین پلیمریزاسیون ایجاد شیب PH می کنند ، که بطور کووالانت از طریق باندهای وینیل به شبکه پلی آکریل آمید متصل می شوند .
روشهایی برای آماده سازی دستی این ژلها وجود دارد ، که البته اکنون از این روشها به ندرت استفاده می شود و بیشتر نوارهای IPG آماده ، مورد مصرف قرار می گیرند . در روشهای دستی ، ژلهای تخت IPG تا محدوده PH مورد نظر بر روی ورقه های شفاف Gel Bound Tagged Films ریخته می شوند که ژل پلی آکریل آمید به خوبی به آنها متصل می شود . ژل ها پس از پلیمریزه شدن ، کاملا با آب دیونیزه شده ، شسته می شوند . یعنی 6 بار و هر بار به مدت 10 دقیقه در آب دیونیزه و بعد در گلیسرول 2% به مدت 30 دقیقه غوطه ور می شوند و سپس در دمای اتاق در نقطه ای که عاری از هر گونه گرد و غباری باشد ، قرار داده می شوند تا خشک گردند و روی آنها با ورقه ای پوشیده می شود . در صورت عدم تمایل به استفاده سریع از آنها ، می توان آنها را برای مدت یک سال در 20- درجه سانتیگراد نگهداری کرد . قبل از استفاده ژلها به میزان لازم برش داده می شوند . همانطور که ذکر شد نوارهای IPG از پیش آماده ، در بازار موجود هستند . این نوارها در طولهای متفاوت بوده و هر چه میزان طول نوارها بلندتر باشد ، تعداد پروتئین هایی که می توانند از هم تفکیک گردند بیشتر خواهد بود . نوارهای 18 یا 24 سانتیمتری معمولا برای جداسازی با قدرت تفکیک بالا استفاده می شوند ، در حالیکه نوارهای 7 یا 11 سانتیمتری برای غربالگری سریع نمونه ها مورد استفاده قرار می گیرند .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در روشهای آماده سازی نمونه ، رسوب دادن پروتئین ها به عنوان یک مرحله اختیاری تلقی می گردد . این روش برای جدا کردن انتخابی پروتئین ها از مواد آلاینده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها ، دترجنت ها ، اسیدهای نوکلئیک ، و غیره به کار گرفته می شود . از این روش برای تغلیظ پروتئین های موجود در یک نمونه که در حالت عادی بسیار رقیق باشند ، نیز استفاده می شود .
باید توجه داشت که هیچ روش رسوب دهی به طور کامل کارامد نیست و برخی از پروتئین ها بعد از رسوب داده شدن ، مجددا محلول نمی شوند . به همین دلیل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی استفاده کردن از این روش را در دستور کار می توان قرار داد . در صورتیکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترین نمایه دو بعدی یک نمونه باشد ، باید از انجام رسوبدهی صرف نظر کرد .
جزء به جزء کردن نمونه(Fractionation)
پروتئین هایی که در بافتهای اوکاریوتی بیان می شوند ، از گوناگونی بسیاری برخوردار بوده ، و دارای محدوده دینامیک (محدوده غلظت پروتئین های داخل یک نمونه بین کمترین تا بیشترین غلظت(Range Dynamic) ) وسیعی هستند . برخی از مواقع در نمونه هایی این چنین ، به منظور کاهش پیچیدگی نمونه و افزایش تعداد پروتئین هایی که دارای نسخه پایین هستند ، نمونه جزء به جزء می شود . می توان از روشهای متفاوتی مانند جزء به جزء کردن اجزاء سلولی (Sub-Cellular Fractionation) ، الکتروفورز در فاز مایع ، کروماتوگرافی جذبی و رسوبدهی انتخابی بهره برد . استخراج پی در پی (Sequential Extraction) پروتئین ها از یک سلول یا بافت بر اساس حلالیت آنها در دسته ای از بافر ها که قدرت و خاصیت محلول سازی آنها به تدریج افزایش پیدا می کند ، روش دیگری از جزء به جزء کردن است .
زمانی که قسمتی از پروتئین های سلول یا بافت مورد نظر باشد ، می توان در حین آماده سازی ، نمونه را نیز جزء به جزء کرد . اگر پروتئین هایی از یک قسمت زیر سلولی خاص مورد نظر باشند ، برای مثال ریبوزوم ها ، می توان ارگانل مورد نظر را توسط سانتریفوژ کردن تمایزی در شیبهای سوکروز جدا نمود . اگر چه این روشها را می توان در سلولهای پستانداران که معمولا دارای جداره سلولی ضعیفی هستند ، نیز به کار برد ، اما دسترسی به اورگانل ها در میکرواورگانیسم های دیگر بسیار مشکل است ، زیرا یک روش لیز کردن برای شکستن کارامد دیواره سلولی مورد نیاز است که در عین حال نباید آنقدر خشن باشد که باعث از بین رفتن ارگانل و تخریب آن شود .
رسوبدهی انتخابی بعضی از کلاسهای پروتئینی توسط استن-TCA صورت می گیرد . دیگر روش ، روشهای عصاره گیری متوالی با بافرهایی که به تدریج قدرت محلول سازی آنها افزایش می یابد ، است . مثلا بافرهای مائی ، حلالهای آلی نظیر اتانول ، کلروفورم و اتانول و محلول های حاوی دترجنتهای مختلف . بالاخره روشهای جداسازی کروماتوگرافی ، الکتروفورز در فاز مائی نیز در جزء به جزء کردن نمونه ها بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی متفاوت پروتئینهای موجود در نمونه قابل انجام هستند . تصمیم در انتخاب هر یک از این روشها بستگی به ماهیت نمونه و هدف از کار با نمونه دارد .
روشهای جزء به جزء کردن ، ممکن است مزایای بسیاری در غنی سازی پروتئین ها داشته باشند ، اما اصلی ترین نکته منفی در استفاده از این روشها ، این است که بسیار زمانگیر و بسیار پیچیده اند . همچنین نمی توان در یک زمان چند نمونه را وارد این مرحله از کار نمود . اما مزیت اصلی آن ،تعیین جایگاه پروتئین ها از نظر ساختمانی در زیر ساختار سلولی و تعیین عملکرد آنها است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در حین لیز سلولی و بعد از آن ، ترکیبات تداخل کننده ای نظیر آنزیمهای پروتئولایتیک ، نمکها ، لیپیدها ، اسیدهای نوکلوئیک ، پلی ساکاریدها ، و فنل های گیاهی باید غیر فعال شده یا از نمونه تهیه شده خارج گردند .
در این بخش به توضیح این آلاینده ها و اثر آنها بر الکتروفورز 2 بعدی پرداخته و روشهای حذف آنها را شرح خواهیم داد .
پروتئازها
پروتئازهای موجود و حاضر در نمونه باید غیر فعال شوند تا از تخریب پروتئین ها جلو گیری شود . در غیر این صورت پروتئازها با شکستن پروتئین ها سبب پدیدار شدن نقاط مصنوعی در نمایه 2 بعدی می شوند . روشهای مختلفی برای مقابله با پروتئولیز ضمن آماده سازی نمونه وجود دارد . برای مثال استخراج پروتئین در PH بازی ، جوشاندن نمونه در SDS و همچنین استفاده از مهار کننده های پروتئازها (PI) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر .
مهار کننده های پروتئاز را می توان به محلول لیز کننده افزود ، اما همیشه این کار توصیه نمی شود . چرا که این مواد ممکن است باعث ایجاد تغییر بار الکتریکی در پروتئین های دیگر شده و سبب ایجاد نقاط مصنوعی شوند . راه حل های دیگر جوشاندن نمونه در بافری با PH بالا نظیر بافر تریس است که دارای SDS باشند . برای غیر فعال کردن پروتئاز ها با PH پایین از رسوب دادن با TCA 20% بر روی یخ می توان بهره برد .
این نکته را باید در نظر داشت که غیر فعال سازی کامل تمام پروتئازها کاری بسیار سخت است . رسوب دهی توسط TCA و استن در کاهش تخریب پروتئین ها و خارج ساختن ترکیبات تداخل کننده معمولا مفید است . اما باید کاملا مراقب بود که پروتئین ها در اثر رسوب دادن ناقص و یا بعد از رسوب دادن ، در حین محلول کردن دوباره ، از دست نروند . نشان داده شده است که محلول های حاوی تیواوره 2 مولار و اوره 7 مولار کارآیی قابل توجهی در مهار کردن پروتئازهای نمونه دارند . تیواوره علاوه بر مفید بودن در حل کردن پروتئین ها به عنوان یک مهار کننده قوی پروتئازها نیز عمل می کند .
اسیدهای نوکلوئیک
حضور اسیدهای نوکلوئیک نیز می تواند در حین IEF مسئله ساز شود . این امر ناشی از افزایش در ویسکوزیته نمونه و در بعضی از موارد ایجاد کمپلکس هایی با پروتئین ها ی نمونه است که منجر به مهاجرت غیر عادی و ایجاد رگه های افقی و عمودی در نمایه ژل الکتروفورز 2 بعدی می شود . اگر مشکلاتی از این قبیل بوجود آید بهترین کار متلاشی کردن اسید نوکلوئیک با یک اندونوکلوئاز خالص و مناسب و عاری از پروتئاز است . روش دیگر استفاده از توانایی آمفولیت ها در ایجاد کمپلکس با اسیدهای نوکلوئیک و بعد خارج کردن این کمپلکس ها با اولترا سانتریفوژ است .
نمک ها
نمکها با تغییر در رسانایی و قدرت عبور جریان الکتریکی در ژلهای IPG باعث اختلال در IEF شده و تا زمانی که یونهای نمک از انتهای نوارهای IPG خارج نشوند فوکوسینگ پروتئین ها اتفاق نخواهد افتاد . همین امر زمان فوکوسینگ را افزایش می دهد . حضور نمک در نمونه ، ممکن است باعث جابجایی آب موجود در نوار IPG نیز شود . به طوریکه یک سمت ژل خشک و سمت دیگر متورم خواهد شد . از طرف دیگر وجود مقادیر زیاد نمک در نمونه باعث می شود پروتئین ها در نواحی نسبتا عریضی در دو انتهای ژل فوکوس نشوند . به همین دلایل نمک اضافی موجود در نمونه ها باید خارج شوند ، یا به کمترین حد ممکن تقلیل یابند . همانطور که قبلا اشاره شده است باید غلظت نمک موجود در نمونه کمتر از 40 میلی مولار باشد . زمانیکه نمونه در حین خیساندن ژل بار گیری می شود ، باید غلظت نمک کمتر از 10 میلی مولار باشد .
برای نمک زدایی از روشهای مختلفی می توان استفاده کرد ، که رایج ترین آنها استفاده از دیالیز ، تغلیظ کننده های غشائی ، ژل فیلتراسیون و رسوب دهی است . دیالیز روشی بسیار کارامد است ، که در آن کمترین مقدار از نمونه از دست داده می شود . اما دارای روندی طولانی مدت است و احتیاج به حجم بالایی از محلول دارد . تغلیظ کننده ها ی غشایی یا دیالیز همراه با سانتریفوژ روش سریع تری هستند . اما امکان اتصال پروتئین ها با غشاء دیالیز در این روش بیشتر است . در ژل فیلتراسیون نیز امکان از دست رفتن پروتئین های نمونه زیاد است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (حامل های آمفولیتی)
حامل های آمفولیتی
حاملهای آمفولایتی با به حداقل رساندن پدیده توده شدن پروتئین ها از طریق ایجاد برهمکنش های ناشی از بارهای الکتریکی موجود بر روی پروتئین ها باعث افزایش حل پذیری آنها می شوند .
یکی از اساسی ترین چالش های IEF تمایل زیاد برخی پروتئین ها به رسوب در نقطه ایزوالکتریکشان است . در برخی از نمونه ها پروتئین هایی وجود دارند که برای حفظ حلالیتشان ، حتی در حضور دترجنت ها ، نیاز به وجود نمک دارند . این امر مشکل ساز است ، زیرا هر گونه نمکی که در محلول وجود داشته باشد ، در حین جریان بالایی که در ابتدای IEF اعمال می شود از ژل خارج می شود . بدین ترتیب پروتئین هایی که برای حلالیت خود نیاز به نمک دارند ، با خارج شدن آن رسوب می کنند . از طرفی دیگر ، وجود نمک باعث محدود کردن ولتاژی می گردد که می توان بدون ایجاد جریان بسیار بالا به آن دست یافت ، و این امر سبب افزایش زمان فوکوسینگ خواهد شد . نمک تنها در صورتی باید در یک نمونه حضور داشته باشد که نیاز اساسی به حضور آن باشد و در این صورت تنها غلظت کمتر از 40 میلی مولار قابل قبول است . حامل های آمفولیتی برای جبران از دست رفتن نمک در این نمونه ها عمل می کنند . این حامل ها معمولا در غلظتی کمتر از 0.2% به کار گرفته می شوند ، چرا که در غلظت های زیاد ، تا زمانی که در نقطه ایزوالکتریک خود فوکوس شوند ، سبب کاهش سرعت IEF می شوند ، چرا که حامل جریان می باشند و این امر سبب محدود شدن ولتاژ می گردد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (عوامل احیاء کننده)
عوامل احیاء کننده
عوامل احیاء کننده گروه تیول برای شکستن پیوندهای دی سولفیدی داخل و بین مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند . معمولا این مرحله از اهمیت زیادی در محلول سازی برخوردار است . به خصوص برای پروتئین های منفک شده از سلولهای اوکاریوتی که نحوه تاخوردگی آنها بر پایه پیوند های دی سولفیدی استوار است .
مرکاپتواتانول در روشهای ابتدایی الکتروفورز 2 بعدی به کار گرفته می شد . اما به خاطر مشکلاتی که داشت امروزه از آن استفاده نمی شود . در واقع قسمتی از مرکاپتواتانول در PH بازی یونیزه می شود و داخل قسمت بازی ژل IEF می گردد و به خاطر قدرت بافر کنندگی موجب تخریب شیب PH در قسمت بازی می شود . اگر چه دی تیو تریتول (DTT) دارای pKa حدود 8 است ، اما به دلیل اینکه در غلظت بسیار کمتری استفاده می شود ، ( معمولا 50mM در مقایسه با 700mM موجود در 5% مرکاپتواتانول ) ، ایجاد مشکل مرکاپتواتانول را نمی کند .
دی تایوترایتول DTT و دی تایو اریتریتول DTE ، (Dithioerythritol) رایجترین عوامل احیا کننده مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها و IEF هستند . این معرف ها در یک واکنش تعادلی اکسیده شده و در عوض باعث احیاء پیوندهای دی سولفیدی می شوند . به همین دلیل معرفهای احیاء کننده در مقادیر اضافی ( حداکثر تا 100 میلی مولار ) مورد استفاده قرار می گیرند .
ساختمان شیمیایی DTE و DTT و واکنش آنها با پروتئین ها
به هر حال معرفهایی نظیر DTT و DTE کمی اسیدی و دارای بار الکتریکی هستند ، به همین دلیل در حین الکتروفوکوسینگ به سمت آند مهاجرت می کنند که این امر می تواند منجر به اکسیداسیون مجدد پروتئین های نمونه ، از دست دادن حلالیت نمونه در حین الکتروفورز و ایجاد رگه های افقی در قسمت بازی ژل شود . مخصوصا زمانی که از شیبهای IPG بازی بر روی بعد اول استفاده می شود . این پدیده مشهود تر است . این مسئله را می توان با قرار دادن یک کاغذ الکترود اضافی که در 20 میلی مولار DTT خیسانده شده است . بر روی کاتد حل کرد . بدین ترتیب جایگزینی DTT داخل ژل که به سمت آند حرکت می کند با DTT که این کاغذ در کاتد آزاد می گردد ، تضمین خواهد شد . روش دیگر برای اجتناب از وقوع این پدیده و حفظ قدرت تفکیک ، عدم انجام فوکوسینگ در زمانهای طولانی است .
فسفاین ها (Phsphines) می توانند جایگزین معرفهای احیاء کننده تیول باشند . معرف احیاء کننده بدون بار الکتریکی نظیر تری بوتیل فسفین Tributhyl phosphine , TBP در تمام طول IEF شرایط احیا را حفظ می کند . بدین ترتیب از ایجاد توده های پروتئینی ناشی از ایجاد مجدد پیوندهای دی سولفیدی ممانعت می نماید . علاوه بر این مزیت دیگر TBP امکان استفاده از آن در IEF با شیب های PH بازی است ، چرا که در این شیبها نیز شرایط احیا کنندگی را حفظ می نمایند . از خصوصیات دیگر فسفین ها عدم واکنش دهی شان با برخی از عوامل آلکیله کننده نظیر آکریل آمید و 4- وینیل پیریدین است . در زمان متعادل سازی می توان از این خاصیت برای طراحی یک مرحله ای احیا و آلکیلاسیون با TBP و آکریل آمید استفاده کرد . باید به این نکته توجه کرد که اسیدهای آیودو استیل و آمین ها با فسفینها واکنش می دهند و اگر در آلکیلاسیون از این مواد استفاده شود باید مراحل احیا و الکیلاسیون به صورت جداگانه صورت پذیرند .
فسفاین ها با زنجیره کوتاه مثل TBP در غلظتهای استوک ، موادی فرار ، سمی ، و به شدت قابل اشتعال هستند . اگر چه استوک های رقیق شده را می توان با امنیت مناسب مورد استفاده قرار داد ، اما مشکل در حمل و نقل استوکهای غلیظ است . در عین حال قیمت TBP در مقایسه با DTT بسیار بیشتر است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (معرفهای کائوتروپیک)
بافرهای محلول سازی
بافرهای محلول سازی ممکن است به تنهایی یا در ترکیب با روشهای دیگر متلاشی سازی سلولی به کار گرفته شوند . برای انجام جداسازی مناسب در بعد اول ، نمونه های پروتئینی باید کاملا غیر توده ای و به صورت محلول باشند . این امر برای تمامی انواع نمونه ها در هر مرحله ای از آماده سازی ضروری است . برای این منظور معمولا ، در ترکیب بافرهای محلول سازی از یک یا دو معرف کائوتروپیک ، دترجنت ، معرف احیا کننده ، و آمفولیت استفاده می شود .
در این قسمت به معرفی این اجزاء و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازی نمونه برای انجام الکتروفورز 2 بعدی می پردازیم .
معرفهای کائوتروپیک
بسیاری از پروتئین ها در اشکال طبیعی (Native) دارای چندین شکل فضایی مختلف هستند و به همین دلیل ممکن است در الکتروفورز 2 بعدی الگوهای پیچیده ای ایجاد کنند . این وضعیت تفسیر نمایه های 2 بعدی را دچار مشکل خواهد کرد . برای ساده تر کردن نمایه دو بعدی و حذف اثر شکل فضایی در ایجاد نقاط متعدد مربوط به یک پروتئین و ایجاد پیکی منفرد از آن ، بر هم زدن شکل طبیعی (Denaturing) توسط معرف ها کائوتروپیک انجام می شود .
اوره بهترین عامل کائوتروپیک در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دو بعدی است ، که معمولا با غلظت 8 مولار استفاده می شود . اوره از 2 طریق مستقیم و غیر مستقیم باعث بر هم زدن شکل طبیعی و باز شدن تا خوردگی (Unfolding) مولکولهای پروتئینی می شود . مولکولهای اوره مستقیما جذب گروههای آبدوست (Hydrophill) و قطبی در سطح پروتئین ها می شوند . این مولکولهای جذب شده به گروههای قطبی ، اثر دفعی بر یکدیگر دارند . برا اثر این نیروهای دفعی بر سطح ، مولکول پروتئین باز شده و متورم می گردد . همین امر گروههای آبگریز در سطوح داخلی پروتئین را در معرض محیط خارجی قرار می دهد . ورود آب و اوره به محیط داخلی پروتئین سبب ایجاد بی ثباتی و بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین می شود .
از طرف دیگر اوره از طریقی غیر مستقیم و با تغییر در ساختار و دینامیک آب می تواند در بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین مؤثر باشد . حضور این ماده باعث اختلال در شبکه پیوند هیدروژنی بین مولکولهای آب شده و ایجاد فضایی خالی در بین مولکولهای آب می نماید . این کاهش نا مطلوب در آنتروپی با فشار مولکولهای آب به مولکولهای آبگریز جبران می شود ، تا کمترین فضای ممکن را ایجاد نمایند . این پدیده به اثر آبگریزی (Hydrophobic Effect) موسوم است . اوره در غلظتهای بالا (6 الی 8 مولار ) ، نیروهای مؤثر در متراکم کردن ساختمان پروتئین ها به خصوص اثر آبگریزی را کاهش می دهد . به این ترتیب به طور غیر مستقیم ، قسمتهای مرکزی آب گریز در معرض و در دسترس عوامل محیطی قرار می گیرد .
زمانی که به شرایط کائوتروپیکی قوی نیاز باشد ، ترکیبی از تیواوره 2 مولار و اوره 5 الی 8 مولار مورد استفاده قرار می گیرد . تیواوره در مقایسه با اوره دناتوره کننده قوی تری است . اما نمی توان آن را به تنهایی مورد استفاده قرار داد ، چرا که حلالیت بسیار کمی در آب دارد . این ماده در محلول غلیظ اوره حلالیت بیشتری دارد . به همین دلیل مخلوط های اوره – تیواوره قدرت محلول کنندگی بهتری را از خود نشان می دهند . به علاوه این ترکیب قادر به جلوگیری از فعالیت آنزیمهای پروتئولیتیک نیز هست که در حضور اوره به تنهایی هم ممکن است فعال باقی بمانند .
درجه خلوص اوره بسیار مهم است و باید از حرارت دادن آن ، به دلیل تشکیل ایزوسیانات که از تجزیه اوره حاصل می شود ، خودداری کرد . ایزو سیانات باعث کربامیلاسیون پروتئین ها و تشکیل نقاط غیر واقعی در الگوی نهایی الکتروفورز 2 بعدی می شود . محلول حاوی اوره پایدار نیست و از ذوب و انجماد مکرر محلول حاوی اوره باید خودداری کرد . از طرفی دیگر ، اگر چه استفاده از تیواوره در نمونه باعث افزایش در بروز نقاط پروتئینی می شود ، اما ایجاد رگه های (Streaking) عمودی و نقاط مبهم و نامشخص در ناحیه اسیدی ژل را نیز سبب می شود که هنوز راه حل مناسبی جهت حذف این زواید پیدا نشده است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در نظر گرفتن ماهیت نمونه ، در انتخاب راهکار مناسب برای محلول ساختن پروتئینهای موجود در نمونه بسیار مهم است . در صورتیکه نمونه مورد نظر از منابع سلولی یا بافتی استخراج شود ، اولین قدم لیز سلولها و خارج کردن محتوای پروتئینی آنهاست . روشهای متفاوت مکانیکی و شیمیایی در لیز و متلاشی ساختن سلولها به کار گرفته می شود. این روشها ممکن است ، روشهای ملایمی چون شکست دیواره سلول باکتریها توسط آنزیم لایزوزایم(Lysozyme) ، یا روشهای خشنی چون استفاده از پرس فرانسوی (French press) برای متلاشی ساختن سلولهای مخمری باشد .
به هر حال در روش مطلوب محلول سازی برای الکتروفورز دو بعدی باید تمام پیوندهای غیر کووالانت در کمپلکسهای پروتئینی ، شکسته شده و تجمع پروتئینی به پلی پپتیدهای منفرد و محلول تبدیل شوند . به علاوه روش محلول سازی باید اجازه خارج ساختن موادی نظیر نمکها ، لیپیدها ، پلی ساکاریدها و اسیدهای نوکلوئیک را که می توانند باعث اختلال در جدا سازی توسط الکتروفورز دو بعدی شوند ، به وجود آورد . در نهایت پروتئین ها ی نمونه باید در حین روند الکتروفورز دو بعدی ، محلول باقی بمانند . به همین دلایل محلول شدن نمونه یکی از عوامل بسیار حساس برای جداسازی پروتئینها توسط الکتروفورز 2 بعدی است .
روشهای متلاشی ساختن سلولها
روشهای متلاشی ساختن سلولها به منظور استخراج محتوای پروتئینی آنها ، دامنه وسیعی از روشهای فیزیکی و شیمیایی ملایم تا خشن را در بر می گیرد . ممکن است لیز سلولی به طور مستقیم در تماس با بافر محلول سازی صورت پذیرد یا در مواردی ممکن است از امواج مافوق صوت (Sonication) برای این منظور استفاده شود . حتی در برخی موارد ترکیبی از روشهای مختلف برای نیل به استخراج کامل پروتئین های نمونه استفاده می گردد .
متلاشی ساختن نمونه ها باید در سرما صورت پذیرد و نمونه مورد نظر در حین این روند باید روی یخ نگهداری شود . برای حفظ نمونه های پروتئینی از عملکرد پروتئاز های آزاد شده در حین متلاشی ساختن سلولها باید تمهیداتی در نظر گرفته شود . یکی از روشهای معمول متلاشی ساختن مستقیم سلولها در محلولهای لیز کننده ای است که سریعا پروتئاز ها و دیگر فعالیت های آنزیمی را متوقف کند . این محلولها عموما دارای مواد دناتوره کننده قدرتمندی هستند .
الف- روشهای متلاشی ساختن ملایم
این روشها معمولا زمانی به کار گرفته می شوند که نمونه مورد نظر حاوی سلولهایی است که به راحتی لیز می شوند ، سلولهایی نظیر سلولهای بافتی کشت داده شده ، سلولهای خونی و برخی از میکرو اورگانیسم ها . به علاوه از این روشها در مواردی هم که فقط تمرکز در بررسی یکی از اجزاء تحت سلولی است ، استفاده می شود . برای مثال می توان شرایطی را انتخاب کرد که فقط پروتئین های سیتو پلاسمیک آزاد شوند . یا میتوکندری های دست نخورده یا ارگانلهای دیگر توسط سانترفوژ تمایزی جدا شوند . برخی مواقع این روشها در ترکیب با یکدیگر استفاده می شوند . از روشهای ملایم متلاشی سازی سلولی می توان موارد زیر را نام برد .
1- لیز توسط دترجنت
دترجنت ها غشاء سلولی را حل می کنند و باعث لیز سلول و آزاد کردن محتوای آن می شوند . در بیشتر موارد سلولها مستقیما در بافر محلول سازی یا بافر خیساندن Rehydration Buffer لیز می شوند . چرا که این بافرها همیشه دارای دترجنت هستند . رایج ترین روش برای محلول سازی پروتئین ها در الکتروفورز 2 بعدی همان روشی است که در ابتدا توسط Farrell در سال 1975 شرح داده شده است . در این روش از اوره 9.5 M ، 4% دترجنت غیر یونی NP40، 1% ماده احیاء کننده دی تیو تریتول (DDT) و 2%آمفولایت (Ampholyte) در محدوده مناسب استفاده شده است که به آن اصطلاحا بافر لیز کننده (Lysis Buffer) می گویند . در حالی که این روش در بسیاری از انواع نمونه ها به خوبی نتیجه می دهد ، نمی توان از آن به طور گسترده ای استفاده کرد . چرا که محلول سازی پروتئین های غشایی چالش این روش است . دترجنت های دو یونی (Witterionic) ، مانند CHAPS ، در محلول سازی پروتئین های غشایی بسیار مؤثرند . به خصوص که با غلظت 4% و در ترکیبی با مخلوطی از تیواوره 2M و اوره 8M استفاده شود . دترجنتهای سولفوبتائین خطی نظیر SB3-10 یا SB3-12 نیز معرفهای حل کننده مؤثری هستند ، اما با غلظتهای بالای اوره سازگار نیست . این مسئله با استفاده از غلظت 2% این معرفها در ترکیب با اوره 1M و تیواوره 2M و CHAPS2% برطرف شده است . دترجنت سدیم دودسیل سولفات SDS نیز قادر است واکنشهای پروتئینی غیر کووالانت را بشکند و معرف بسیار مؤثری در محلول سازی پروتئینهای غشایی است . اما خاصیت آنیونیک این ماده استفاده از آن را در IEF دچار مشکل می نماید . در هر صورت می توان از SDS به عنوان یک روش پیش محلول سازی ، در مورد نمونه هایی که قرار است الکتروفورز 2 بعدی گردند ، استفاده کرد . در این روش ابتدا نمونه در محلول 1%SDS حل می شود و بعد با محلول های حل کننده عادی مانند بافر لیز کننده رقیق می شود . در اینجا هدف خارج کردن SDS از پروتئین ها و جایگزینی آن با دترجنت های دو یونی یا غیر یونی است ، تا پروتئین ها در وضعیت محلول باقی بمانند . نسبت پروتئین به دترجنت دو یونی یا غیر یونی 1:3 و نسبت SDS به این دترجنتها 1:8 است و این نسبت ها باید به دقت کنترل گردند ، تا محلول سازی کاملا انجام شود و در عین حال اثرات مخرب SDS بر روی IEF به حداقل برسد .
2- لیز اسموزی
این روش در مواردی که نیاز به جدا سازی اجزاء تحت سلولی است به کار گرفته می شود . سلولهای خونی و سلولهای کشت بافتی به این روش پاسخ مطلوبی می دهند . در این روش سلولها در محلولی هیپواسموتیک Hyposmotic قرار داده می شوند .
3- لیز توسط یخ زدن و ذوب کردن (Freez-thaw lysis)
در این روش سلولها در یک یا چند نوبت متوالی به سرعت در نیتروژن مایع ، یخ زده می شوند و سپس ذوب می شوند .
4- لیز آنزیمی
دیواره سلولی در بافتهای گیاهی ، سلولهای باکتریایی و قارچی را می توان با استفاده از آنزیم اختصاصی برداشت . و سپس سلول را لیز کرد . لایزوزایم برای سلولهای باکتریایی ، سلولاز و پکتیناز برای سلولهای گیاهی ، و لایتیکاز برای مخمرها در یک محلول ایزواسموتیک حل شده و مورد استفاده قرار می گیرد .
ب- روشهای متلاشی ساختن خشن
سلولهای موجود در بافت ها و سلولهایی که دیواره سلولی مستحکمی دارند ، به سهولت متلاشی نمی شوند و باید از این روشها برای لیز آنها استفده کرد . باید در هنگام استفاده از این روشها ، از ایجاد حرارت و کف ممانعت کرد .
1-استفاده از امواج مافوق صوت
امواج صوتی تولید شده توسط یک سونیکاتور باعث لیز سلولها از طریق ایجاد برشهایی در دیواره سلولی می شوند . زمانیکه امواج مافوق صوت حداکثر تلاطم را در سیستم سلولی به وجود می آورند ، این برشها ایجاد می شوند .برای ممانعت از افزایش درجه حرارت سوسپانسیون سلولی و ایجاد کف ، ظرف سوسپانسیون سلولی در حمام یخ قرار داده می شود . و سونیکاسیون در مقاطع زمانی کوتاه مدت با فواصل زمانی معین صورت می پذیرد .
2-پرس فرانسوی
ایجاد پارگی در دیواره سلولی در این روش به دلیل گذر دادن سوسپانسیون سلولی از منفذی بسیار کوچک تحت فشار بسیار زیاد است . این روش بسیار ساده ، کارآمد و سریع است و معمولا برای میکرو اورگانیسم های دارای دیواره سلولی به کار برده می شود .
3-آسیاب کردن (Grinding)
برخی از مواقع از سیستم هاون دستی مخصوص برای آسیاب سوسپانسیون سلولی یا بافت ها استفاده می شود . برای این منظور قطعه بافتی مورد نظر سوسپانسیون سلولی در نیتروژن مایع یخ زده می شود و با این هاون سلولی پودر می شوند . می توان برای بهبود این روش به مخلوط در حال هاون شدن ، شن یا آلومینا (Al2O3) اضافه کرد .
4-هموژنیزه کردن
این روش ممکن است بصورت مکانیکی با کمک همزنهای برقی صورت گیرد که عموما برای نمونه های بافتی به کار گرفته می شود . استفاده از دانه های شیشه ای (Glass Bead) روش دیگر برای هموژنیزه کردن نمونه های سوسپانسیون سلولی است که با همزدن شدید سوسپانسیون حاوی این دانه ها ی شیشه ای در فواصل زمانی تکراری صورت می گیرد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
به خاطر تفاوت در ماهیت و ساختار در انواع نمونه ها , روشهای آماده سازی برای نمونه هایی که از منابع مختلف به دست می آیند , با هم اختلاف دارند . در ذیل این مقاله ، این نمونه ها را به انواع مختلف تقسیم بندی کرده ، در مورد آن توضیح می دهیم .
1- نمونه های محلول :
نمونه های محلول و مایع نظیر ، سرم ، پلاسما ، مایع نخاعی و عصاره مایع سلولها و بافتها را می توان در اکثر موارد با کمترین تغییر و دستکاری ، توسط الکتروفورز 2 بعدی بررسی و مطالعه کرد .
نمونه هایی مانند سرم و پلاسما را که دارای غلظت بالایی از پروتئین ها هستند ؛ را می توان با رقیق سازی توسط بافرهای محلول کننده مناسب ، برای انجام تست الکتروفورز 2 بعدی آماده کرد . در این روش بالا بودن غلظت بعضی از پروتئین ها ، مثل آلبومین و یا ایمونوگلوبین ها ، می تواند باعث پوشاندن بعضی از پروتئین ها که غلظت کمی دارند گردد . با خارج کردن این پروتئین ها می توان این مشکل را از بین برد . اما با خارج کردن این پروتئین ها ممکن است ، بعضی دیگر از پروتئین ها نیز خارج گردد .
2 موضوع دیگر نیز ممکن است ، در الکتروفورز 2 بعدی ایجاد مشکل نماید .
الف- وجود نمک های اضافی در محلول
ب- غلظت کم پروتئین ها در محلول
مشکل اول را می توان با دیالیز نمونه و یا کروماتوگرافی با sephadex G25 حل کرد و نمک های اضافی را از نمونه خارج کرد . مشکل دوم را می توان با رسوب دادن پروتئین ها ، به وسیله موادی که باعث رسوب کردن آنها می شود ، حل کرد . موادی مثل ؛ آمونیوم سولفات ، TCA ، یا استن . همچنین می توان با خارج کردن آب از نمونه ، آن را غلیظ کرد . مثل دیالیز در مقابل پلی اتیلن گلایکول و یا لیوفیلیز کردن نمونه .
رسوب دادن نمونه با استن – TCA برای غیر فعال کردن پروتئاز ها و خارج کردن مولکولهای تداخل کننده و برای تغلیظ پروتئین های بسیار قلیایی ، مثل پروتئین های ریبوزومی ، در محلول لیز شده سلولی بسیار مفید می باشد .
2- نمونه های بافتی :
برای تهیه نمونه از بافت جامد , معمولا بافت را توسط بافر محلول کننده ، حل می کنند . بهترین روش استفاده از نیتروژن مایع است . نمونه های کوچک را که در یک فویل آلومینیومی قرار دارد و در نیتروژن مایع , یخ زده است ، را می توان به راحتی در یک هاون خرد کرد . نمونه های بزرگ را می توان با هموژنه کردن در بافر محلول کننده ، توسط هموژنایزر آماده کرد . برای اینکه بتوان از آسیب پذیری پروتئین ها در اثر حرارت جلوگیری کرد ، باید حرارت تولید شده توسط هموژنایزر را از محیط نمونه خارج کرد .
مشکل خاص در آنالیز نمونه های بافتی ، عدم وجود یک دستی در ماهیت بافت است . همانطور که می دانیم بافت ها از انواع مختلف سلول تشکیل شده است . حتی یک نوع سلول نیز ممکن است از اختلاط سلولهای سالم و ناسالم تشکیل شده باشد . روشهای مختلفی برای جداسازی و تفکیک این سلولها وجود دارد . با استفاده از گزینش مثبت یا منفی و معمولا بر اساس یک روش ایمونوافینیتی ، امکان غنی سازی یک سلول خاص از جمعیت کل آنها و کشت آن قبل از انجام تست وجود دارد . همچنین از روشهای میکروسکوپی مانند (Laser Capture microdessection LCM ) نیز می توان برای جداسازی آنها استفاده کرد .
البته روش LCM برای آنالیز اسیدهای نوکلئیک بهتر است ، چون در کنار آن از PCR برای تولید و تقویت اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود ، اما در آنالیز پروتئین ها ، دستگاهی که کار PCR را انجام دهد و پروتئین ها را افزایش دهد ، وجود ندارد .
3- نمونه های سلولی :
نمونه هایی که در محیط آزمایشگاه به صورت سوسپانسیون رشد داده می شود و یا نمونه هایی مانند خون ، لنفوسیتها و غیره را سانتریفوژ کرده ، توسط PBS (بافر فسفات سالین) شستشو کرده و در بافر محلول کننده حل می نمایند .
سلول هایی که در محیط جامد کشت داده می شوند را ابتدا باید از محیط کشت جدا کرد . قبل از جدا کردن سلول ها بهتر است آنها را با یک بافر ایزوتونیک شستشو کرد . برای این منظور محلول ایزوتونیک سوکروز پیشنهاد می گردد . زیرا یونهای موجود در بافر PBS ممکن است در نتیجه الکتروفورز تأثیر منفی گذاشته و تداخل ایجاد نماید . در صورت استفاده از PBS می توان نمونه را قبل از انجام تست ، دیالیز کرد . پس از شستشو سلول ها را توسط لوپ یا اسکراپر برداشته و در بافر محلول کننده حل نمایید .
در صورتی که نمونه حاوی مقادیر زیادی اسید نوکلئیک باشد ، ویزکوزیته آن بالاست . در این مورد می توان از RNase و DNase استفاده کرد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بنا به درخواست عده ای از دوستان ، مبنی بر اینکه خواستار انجام تست الکتروفورز 2 بعدی توسط ما شده بودند ، تصمیم بر این گرفته شد ، با شرایطی این کار انجام شود .
1- آماده سازی مقدماتی نمونه با خود ایشان باشد . (در صورت نیاز جهت آماده سازی نمونه مشاوره داده خواهد شد )
2- تهیه ژل IPG توسط ایشان .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
راهنمایی های کلی در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز 2 بعدی (2DE)
روش آماده سازی نمونه علاوه بر کارآمد بودن ، باید تکرار پذیری نیز داشته باشد . این نکته بسیار مهم است . در نمونه سازی ممکن است از مواد زیادی مانند دترجنت ها ، عوامل کائوتروپیک و عوامل احیا کننده استفاده شود . در هر حال بهینه کردن روش آماده سازی نمونه به صورت تجربی صورت می پذیرد . اما موارد زیر را می توان در نظر داشت .
1- به حداقل رساندن مراحل آماده سازی نمونه :
افزایش مراحل آماده سازی نمونه اگر چه در مواردی موجب بهبود کیفیت نمونه می گردد ، اما اکثرا موجب هدر رفتن وقت و مواد و نیز از دست رفتن پروتئین ها می گردد .
2- ممانعت از توده ای شدن پروتئین ها :
پروتئین ها به هیچ وجه در نمونه و یا در مراحل بعد از الکتروفورز ، نباید رسوب و یا حلالیت آنها از بین برود .
3- خارج کردن اسیدهای نوکلوئیک و دیگر مولکولهای تداخل کننده :
مانند نمک ها و چربی ها و قند ها
4- حذف موادی که می توانند تولید ذره نمایند :
این مواد ( لیپیدها و مواد جامد ) باید از محیط نمونه خارج گردند .
5- محلول سازی تمام انواع پروتئین ها ( چه آبگریز و چه آبدوست ) :
باید تمام انواع پروتئین ها در محلول به صورت آزاد باشند ، یعنی تمام پیوند های غیر کووالان در کمپلکس ها و توده های پروتئینی از بین برود .
6- به حداقل رساندن تغییرات پروتئینی در نمونه :
مانند اثر آنزیم ها و اثر گرما
7- حذف پروتئین هایی که فراوانی زیادی در نمونه دارند :
این پروتئین ها ، دیگر پروتئین های نمونه را تحت پوشش می دهند.
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
قدم اول در آماده سازی نمونه استخراج پروتئین ها از منبع مورد نظر است . ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیما توسط بافر محلول سازی Solubilization Buffer صورت پذیرد . ممکن است این عمل توسط روش های متلاشی ساختن سلولها Cell disruption و بافتها انجام شود و سپس پروتئین های استخراج شده در بافر محلول سازی کاملا حل شوند . برای استخراج کامل پروتئین های داخل سلولی ، سلول باید کاملا متلاشی شود . انتخاب روش متلاشی سازی بستگی به این دارد که نمونه از چه منبع بیولوژیکی ، سلول ، بافت جامد و یا از منابع دیگری ، به دست آمده باشد . بعد از استخراج ، این نمونه ها باید برای انجام الکتروفورز دو بعدی آماده شوند . منظور از آماده سازی نمونه ، محلول ساختن حداکثر پروتئین های موجود و حفظ حلالیت آنها در حین روند الکتروفورز دو بعدی است .
هیچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هایی که توسط الکتروفورز دو بعدی مورد بررسی قرار می گیرند ، معرف کرد . در واقع ماهیت متفاوت نمونه ها امکان به کار گیری روشی یکسان را در آماده ساختن آنها برای الکتروفورز دو بعدی منتفی می سازد . از طرفی دیگر ، روش بکار گرفته شده در هر تجربه ای به هدف طراحی شده نیز بستگی دارد . برای مثال ، ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی دستیابی به پروتئین هایی با ویژگی های خاص باشد ، یا ممکن است دستیابی به نقشه کامل پروتئینهای نمونه ، از اهمیت بیشتری برخوردار باشد . در هر یک از این موارد استراتژی های انتخابی کاملا با هم تفاوت دارند . در بهینه سازی استراتژی آماده سازی نمونه باید از نتایج مورد نظر ، انتظاری مشخص داشت . باید برای ما مشخص باشد که نشان دادن نمونه به طور کامل مهمتر است ، یا به دست آوردن یک الگوی تکرار پذیر .
اضافه کردن مراحل آماده سازی نمونه می تواند کیفیت نتیجه نهایی را بهتر کند ، اما این امر به قیمت از دست دادن گروهی از پروتئین ها تمام می شود . به هر حال ، این تناقض و نسبت معکوس بین کیفیت نمونه بهبود یافته و نمونه سازی کامل پروتئین ها باید کاملا در نظر گرفته شود .
در هر صورت ، خطوط راهنمای کلی ،برای آماده سازی نمونه وجود دارد که با پیگیری آنها می توان قدمهای نخست را در این راه به درستی برداشت و سپس با تجربه بهترین نمونه را بدست آورد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
برای اینکه بدانیم یک نمونه استخراج شده ، از چه تعداد پروتئین تشکیل شده است و بتوانیم پروتئین ها را مورد بررسی قرار دهیم ، از این روش استفاده می کنیم . در حقیقت با این روش نقشه پروتئینی یک نمونه را به دست می آوریم . همان گونه که می دانیم یک موجود زنده در شرایط متفاوت ، رفتار های متفاوتی را از خود نشان می دهد ، تا خود را با آن شرایط تطبیق دهد . مثلا تغییر در محیط کشت یک باکتری ، از نظر رژیم غذایی ، باعث ترشح آنزیم های متفاوتی می شود . اگر در محیط کشت نشاسته وجود داشته باشد ، باکتری آنزیمی را ترشح می کند ، که بتواند آن نشاسته را هضم کند . اگر در محیط کشت باکتری از چربی یا پروتئین استفاده شود ، باکتری آنزیمی ترشح می کند که بتواند آنها را هضم کند . پس تغییر در محیط کشت از نظر رژیم غذایی ، باعث تغییر کمی و کیفی در پروتئین های باکتری و به دنبال آن تغییر در نقشه پروتئوم آن باکتری می شود . همینطور تغییرات فیزیکی و شیمیایی در پیرامون باکتری ، سبب تغییرات در نقشه پروتئوم باکتری می شود . در سایر موجودات نیز این تغییرات ثبت شده اند . مثلا آنزیم پراکسیداز در ترب سیاه سالم و ترب سیاه ضخمی شده از نظر مقدار تفاوت دارد . این تغییرات را می توان با روش الکتروفورز 2 بعدی مشخص نمود.
در این روش پروتئین ها در محور X توسط میدان الکتریکی و اختلاف در PI آنها جدا می شوند . سپس در محور Y بر اساس تفاوت در جرم مولکولی جداسازی می شوند. به این ترتیب یک نقشه پروتئینی برای یک نمونه تشکیل می شود .
نویسنده : ابوذر عسکری
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
(2): محلول ثبوت دو : 40ml اتانول و 10ml اسید استیک را توسط آب مقطر به حجم 100ml برسانید.
(3): محلول گلوتار آلدهید 10%: 20ml از محلول استوک 50% گلوتار آلدهید را با آب مقطر به حجم 100ml برسانید.(به علت گرانی این ماده می توان از محلول رقیق تر استفاده کرد ولی زمان بیشتری را در نظر گرفت )
(4): محلول رنگ آمیزی (محلول نقره آمونیاکی): 21ml محلول هیدروکسید سدیم 0.36% و 1.95mlمحلول آمونیاک 25% را در یک ارلن بریزید. سپس در یک لوله آزمایش ، 0.8g نیترات نقره و 4ml آب مقطر ریخته ، حل می کنیم . محلول نیترات نقره را ، قطره قطره به محتویات ارلن اضافه کنید.
در صورت دیدن رسوب قهوه ای ، به آن دو قطره آمونیاک اضافه کنید و ظرف را تکان دهید تا محلول شفاف شود . حجم نهایی را به 100ml برسانید.
(5): محلول ظهور : 10mg اسید سیتریک و 0.1ml فرمالدهید (35%) را به حجم 200ml برسانید .
(6): محلول متوقف کننده : محلول متوقف کننده همان محلول ثبوت دو (2) می باشد .
مراحل رنگ آمیزی :
1- ابتدا ژل را توسط آب مقطر و درون ظرفی که روی شیکر قرار دارد به مدت 5 دقیقه بشویید.
2- اب مقطر را از ظرف خارج نمایید .
3- محلول ثبوت (1) را روی ژل ریخته ، جوری که روی آن را بپوشاند. به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.
4- محلول ثبوت (1) را خارج کرده ، محلول ثبوت (2) را به ظرف اضافه نمایید . 20 دقیقه آن را شیک نمایید.
5- ژل را 2 بار و هر بار به مدت 5 الی 10 دقیقه با آب مقطر فراوان شیک نموده ، تا خوب شسته شود .
6- 100ml محلول گلوتارآلدهید را به ظرف اضافه کرده ، به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.
7- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 4 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.
8- محلول رنگ آمیزی را به ظرف اضافه کرده ، آن را به مدت 30 دقیقه شیک نمایید.
9- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 3 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.
10- 100ml محلول ظهور را به ظرف اضافه کرده ، ظرف را تا ظهور باندها ، بسیار آرام تکان دهید.
11- پس از ظهور باندها به صورت مطلوب ، قبل از تیره شدن زمینه ژل ، محلول ظهور را به سرعت خارج کرده ، محلول متوقف کننده را اضافه نمایید.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اين روش رنگ آميزی به حساسيت روش نقره است و تنها یک ساعت طول می کشد. این روش رنگ آميزی نگاتيو است که در آن زمينه ژل به جاي پروتئين ها رنگ می شود. رنگ به صورت کمپلکسي از "SDS" و ايميدازول روی و به رنگ سفید کدر در ژل رسوب ميکند . مناطقی از ژل که حاوی پروتئين هستند شفاف باقی می مانند . برهم کنشی بين رنگ و پروتئين وجود ندارد ودر صورت نياز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدايی کرد . اين روشها را برای ژلهای 2-D آناليتيکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد . برای ژلهای نازک تر ( کمتر از يک ميلی متر ) زمان انکوباسيون در روش ايميدازول- روی را می توان کاهش داد . تکه ژلهايی که توسط ايميدازول- روی رنگ آميزی شده اند را می توان توسط اسيد سيتريک 2% رنگ زدايی کرد .
1- بعد از اتمام الکتروفورز , ژل را به مدت 20min در محلول تثبیت کننده غوطه ور نمایید .
2- محلول را دور ریخته و ژل را 2 بار به مدت 15min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .
3- در محلول شماره 3 به مدت 15min و در انکوباتور , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .
4- محلول شماره 3 را دور ریخته و محلول شماره 2 را به آن اضافه نمایید . 30 الی 60 ثانیه شیک نمایید .
5- وقتی رنگ رضایت بخشی ظاهر شد , می توانید محلول را دور ریخته و به جای آن آب مقطر به ژل اضافه کنید .
در این روش رنگ آمیزی , ژلها اندکی شکننده تر به نظر مي رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نياز به زمينة تيره دارند. همچنین می توانید این روش را همراه با روش کوماسی بلو انجام دهید . به نحوی که پس از رنگ آمیزی کوماسی بلو , مراحل 2 تا 5 را انجام دهید .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اين روش درکمتر از 2 ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. افزودن اتانول و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی ، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد . فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل شده و پروتئين ها را رنگ می کند. در حالی که فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.
تهیه 1000ml محلول رنگ آمیزی :
100ml از محلول آمونیوم سولفات 10% , 20ml از محلول کوماسی بلو 0.1% , 30ml از محلول اورتو فسفریک اسید 3% , 200ml از محلول اتانول 20% , 650ml آب مقطر
نحوه رنگ آمیزی :
1- پس از الکتروفورز، ژل را 2 بار به مدت 3min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید.
2- ژل را در محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو کلوئيدی به مدت 2 ساعت قرار دهید .
3- باندها باید بدون رنگ زدایی دیده شوند , اما می توانید با آب مقطر نیز رنگ زدایی کنید .
نکات مهم :
1- محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد .
2- بلافاصله بعد از رنگ آمیزی با این روش از ژل مورد نظر عکس برداری شود ، زیرا پایداری رنگ آمیزی با این روش کم است (حدود یک الی دو ساعت).
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
مواد ذکر شده را در 250ml آب مقطر حل نمایید . این محلول در یک شیشه قهوه ای (تیره) و در دمای 4c هفته ها قابل استفاده می باشد .
استوک بافر ژل جدا کننده :
SDS : 1.0g
تریس : 45.5g
مواد ذکر شده را در کمتر از 250ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 8.8 برسانید . سپس حجم را به 250ml برسانید .این محلول در دمای 4c ماه ها قابل استفاده می باشد .
استوک بافر ژل متراکم کننده :
SDS : 1.0g
تریس : 15.1g
مواد ذکر شده را در کمتر از 250ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 6.8 برسانید . سپس حجم را به 250ml برسانید .این محلول در دمای 4c ماه ها قابل استفاده می باشد .
محلول استوک آمونیوم پر سولفات :
آمونیوم پر سولفات: 1.0g
ماده ذکر شده را در 10ml آب مقطر حل نمایید. این محلول در یک شیشه قهوه ای (تیره) و به صورت تازه مصرف شود . پیشنهاد اینجانب این است که در 10 میکروتیوب تقسیم شده و در فریزر نگهداری شود و جهت استفاده یکی از آنها را در آورده ، در یک نوبت مصرف نمایید .
بافر مخزن :
SDS : 2.0g
تریس : 6.0g
گلایسین : 28.8g
مواد ذکر شده را در کمتر از 2L آب مقطر حل نمایید . pH را به 8.3 برسانید . سپس حجم را به 2L برسانید .این محلول باید به صورت تازه مصرف شود .
استوک Sample بافر :
SDS : 0.92g
تریس : 0.3g
گلیسرول : 4.0g
برومو فنول بلو : 0.1 % (w/v )
بتا – مرکاپتو اتانول : 2.0ml
مواد ذکر شده را در کمتر از 20ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 6.8 برسانید . سپس حجم را به 20ml برسانید .این محلول در دمای 4c هفته ها قابل استفاده می باشد .
محلول رنگ آمیزی :
کماسی بلو G-250 : 0.5g
متانول : 12.5ml
استیک اسید : 18.75ml
ابتدا رنگ را در متانول حل نمایید . سپس اسید استیک اضافه کنید و با آب مقطر به حجم 250ml برسانید .
محلول رنگ بر :
متانول : 100ml
استیک اسید : 100ml
آب مقطر : 800ml
محلول را به صورت تازه استفاده نمایید .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
SDS-PAGE تکنیکی است که در آن مولکولهای زیستی بر اساس اندازه جداسازی می شود . مولکولهایی چون انواع پروتئین ها , RNA , DNA . ژل آگاروز برای درشت مولکولهایی مانند DNA بهترین گزینه است . SDS-PAGE برای پروتئین های کوچکتر بهتر است .
مواردی که SDS-PAGE کاربرد دارد عبارت است از :
۱- تصدیق اندازه پروتئین ها
۲- شناسایی پروتئین ها
۳- تعیین خلوص پروتئین ها
۴- شناسایی پیوند های دی سولفید
۵- کمیت و مقدار پروتئین ها
۶- آشکار کردن عیوب
SDS یک دترجنت و مخفف sodium dodecyl sulfate می باشد . بعد از اضافه کردن آن , و احاطه کردن پروتئین ها , پروتئین ها بار نسبتا همسان پیدا کرده و به صورت خطی در می آیند . بدین ترتیب جداسازی فقط بر اساس اندازه صورت می پذیرد . تعداد مولکولهای SDS متناسب با تعداد آمینواسیدهای یک پروتئین است . هر مولکول SDS دو بار منفی به پروتئین می دهد . همچنین باعث می شود که نیرو هایی که در تا شدن و تغییر شکل دادن پروتئین ها شرکت می کنند , از بین بروند .
ژل پلی اکریل آمید همانند ژل آگاروز بر اساس اندازه مولکولها , جداسازی می کند . ژل اکریل آمید با پیوندهای عرضی که دارد , مکانی را برای الک کردن مولکولهایی که در اثر جریان الکتریکی در حال عبور می باشند , به وجود می آورد . همه پروتئین هایی که دارای بار منفی هستند , توسط انتهای میدان الکتریکی که دارای بار مثبت می باشد , کشیده می شود , اما شبکه پلیمری در برابر حرکت آنها مقاومت می کند . پروتئین های کوچکتر سریعتر از مولکولهای درشت تر در این شبکه , حرکت می کنند . در نتیجه از مولکولهای درشت تر پایین تر قرار می گیرند . پس جداسازی در روش SDS-PAGE فقط بر اساس اختلاف در اندازه مولکولها می باشد .
پس از اینکه ژل Run شد , شما احتیاج دارید که پروتئین ها را بر روی ژل فیکس کنید . تا پروتئین ها از جای خود حرکت نکند . اسید استیک 25% یک فیکس کننده خوب است و باعث دناتوره شدن پروتئین می گردد . ژل توسط یک رنگ مثل coomasie blue R250 رنگ می شود . رنگ و تثبیت کننده را می توان در یک محلول که حلال آن متانول است به طور همزمان استفاده کرد . رنگ در کل ژل پخش شده و با پروتئین ها کمپلکس می شود(staining) . سپس با یک محلول که حاوی اسید استیک و متانول است ژل شسته می شود تا رنگ از ژل خارج شود و فقط رنگی که با پروتئین ها باند شده است باقی بماند (destain).
بدون SDS , پروتئین با ساختمان اولیه خود و بدون تغییر بار جداسازی می شود , که در این روش جرم مولکولی و بار isoelectric در جداسازی تآثیر گذار است و این روش PAGE نام دارد . SDS تقریبا به نسبت 1.4g برای هر یک گرم پروتئین استفاده می شود .(این نسبت بین 1.1g الی 2.2g SDS برای هر گرم پروتئین تغییر می کند) .
اندازه منافذ SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis :
بیشتر پروتئین ها و نوکلوئیک اسیدها با اندازه و شکل های متفاوت دارای ضریب بار/جرم تقریبا یکسانی هستند . الکتروفورز این مولکولها در محیط مایع , باعث جداسازی مناسبی نمی شود . اما الکتروفورز در محیط ژل (سوسپانسیون نیمه جامد در آب) نتیجه بهتری می دهد . جداسازی پروتئین ها بطور معمول در ژلهای پلی اکریل آمید انجام می شود . این ژل ها توسط پلیمره شدن محلولی از مونومر اکریل آمید که قالب آن از دو شیشه تشکیل شده است , درست می شود . میزان درشتی و ریزی منفذهای پلیمر متناسب است با غلظت پلی اکریل آمید و عامل بوجود آورنده پیوند های عرضی. وقتی یک مخلوط از پروتئین در ژل و در میدان الکتریکی ایجاد شده قرار می گیرد , پروتئین های کوچکتر سریعتر از درشت مولکولها از میان منافذ ژل حرکت می کنند . میزان جابجایی به اندازه منافذ ژل و قدرت میدان الکتریکی بستگی دارد . پس مولکولهای کوچکتر راحت تر از منافذ عبور کرده , در حالی که درشت مولکولها به راحتی جابجا نمی شوند .
در این متد مخلوط پروتئین و SDS که یک دترجنت آنیونی است , توسط گرما با هم باند شده اند . لذا پروتئین ها دیگر ساختمان اولیه را ندارند و فاقد پیوندهای دی سولفید هستند .
ردیابی رنگ در الکتروفورز :
رنگ به کار رفته در محلول پروتئین به آزمایش کننده این امکان را می دهد که متوجه شود پروسه چه میزان پیش رفته است و آیا مدت زمان جداسازی کافی بوده است یا خیر .
عناصر سازنده شیمیایی و نقش آنها :
اندازه مناذ را 2 فاکتور کنترل می کند .(T%) مقدار درصد acrylamide و مقدار پیوندهای عرضی (C%) . کل غلظت مونومر acrylamide-bisacrylamide = T و غلظت عامل پیوند دهنده عرضی = C . اندازه منافذ با افزایش T% کاهش می یابد و با عامل پیوند دهنده عرضی 5% کوچکترین اندازه منفذ را می دهد . هرگونه افزایش و یا کاهشی در C% باعث افزایش اندازه منفذ می شود , زیرا رابطه اندازه منفذ با C% یک رابطه پارابولیک (سهمی گونه) است . و مینیمم آن در 5% می باشد . دو لایه در ژل وجود دارد . یکی stacking و دیگری separating .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
